23 août 2007
Les étapes d'une Fiv et Icsi
Voilà,
tout est là. Les différentes phases et les étapes de la fécondation in
vitro conventionnelle et de l’ICSI. Lors de ma première tentative
j'avais presque du mal à concevoir tout cela. Aujourd'hui, je suis
admirative devant tant de précision et d'avancée de la médecine. Cette
documentation est un hommage au corps médical qui nous aide, nous
les couples infertiles, à avoir ce bb. Et puis c'est une documentation
riche pour savoir comment sera assistée notre conception. Et puis si
petit bout montre son nez, cela sera une trace pour qu'il comprenne
quand il sera grand ce qu'est une fiv icsi...
A toutes celles qui sont en recherche d'infos, bonne lecture.
Recueil des ovocytes
Chaque
ovocyte se trouve au sein d’un follicule ovarien qui se présente sous
la forme d’un antre rempli de liquide (le liquide folliculaire). La
croissance des follicules a été suivie par échographie durant la
stimulation ovarienne et ce n’est qu’à partir d’une certaine taille que
le médecin a décidé de « déclencher » l’ovulation avec une injection
d’hCG. Entre cette injection et l’ovulation, 36h sont nécessaires à la
maturation finale de l’ovocyte. Juste avant que l’ovulation ne se
produise, le médecin aspire le contenu des follicules, qui est ensuite
rapidement examiné sous le microscope, afin de trouver l'ovocyte et de
le transférer dans un milieu de culture adéquat. Lorsque l’ovocyte est
recueilli, il se trouve englobé dans des couches de cellules
folliculaires qui forment le cumulus. Le diamètre de l’ovocyte est
d’environ 0,1 mm alors que celui du complexe cumulus-oophorus est
d’environ 1 mm.
Oocyte englobé dans son cumulus
Préparation du sperme
Origine des spermatozoïdes
Dans la plupart des cas, ils proviennent de sperme éjaculé mais ils peuvent également provenir de l’épididyme (ponction épididymaire ou MESA) ou directement du testicule (biopsie testiculaire ou TESA). Par ailleurs, les spermatozoïdes humains peuvent être congelés avant utilisation, mais il faut savoir que la congélation entraîne une perte de la mobilité d’environ 50 %. En présence de spermatozoïdes de l’épididyme ou du testicule l’ICSI sera systématiquement choisie. En ce qui concerne le sperme éjaculé, c’est principalement la qualité du spermogramme qui déterminera le type de traitement à proposer au couple.
Spermatozoïdes nageant dans un milieu de culture
Spermatozoïdes éjaculés
L’éjaculat
est produit juste après le recueil des ovocytes. Le but de la
préparation du sperme éjaculé est d’éliminer le plasma séminal et de
sélectionner une population de spermatozoïdes mobiles et
morphologiquement normaux. L’une des méthodes couramment utilisée est
la centrifugation des spermatozoïdes auà travers d’un gradient de
densité (PureSperm) : les spermatozoïdes de faible densité (morts,
anormaux) ainsi que les contaminants cellulaires de l’éjaculat
s’accumulent dans les fractions de densité correspondante, alors que
les spermatozoïdes de plus forte densité (mobiles, normaux) traversent
le gradient et se retrouvent dans le fondculot du tube. Les
spermatozoïdes ainsi isolés sont lavés avec du milieu de culture afin
d’éliminer toute trace de PureSperm.
Spermatozoïdes épididymaires
Les
spermatozoïdes de l’épididyme peuvent être aspirés et congelés avant le
cycle de traitement de la femme. Il est aussi possible que l’aspiration
épididymaire se fasse le même jour que le recueil des ovocytes.
Spermatozoïdes testiculaires
La
biopsie testiculaire est déchirée en petits morceaux pour permettre la
libération de spermatozoïdes dans le milieu. Seuls les spermatozoïdes
matures sont utilisés pour l’ICSI. A l’heure actuelle en Suisse, nous
n’utilisons pas les spermatides qui sont des cellules germinales
haploïdes encore immatures. La biopsie peut être prélevée avant le
cycle de traitement de la femme et les spermatozoïdes congelés.
Mise en fécondation des ovocytes
Les ovocytes sont mis en présence de nombreux spermatozoïdes mobiles dont un seul va habituellement féconder l’ovocyte. Les ovocytes prélevés par ponction folliculaire sont placés individuellement ou par groupe de 2 ou 3 dans 0,5 ml de milieu de culture. Les spermatozoïdes préparés sont ajoutés aux ovocytes (50’000-100’000 spermatozoïdes mobiles/ml). Pendant les heures qui suivent, certains spermatozoïdes vont traverser le cumulus et s’attacher à la zone pellucide qui entoure l’ovocyte. La zone pellucide est une barrière importante et le spermatozoïde doit exercer des mouvements vigoureux pour la traverser. En général, un seul de ces spermatozoïdes parvient à traverser la zone pellucide, atteindre la surface de l’ovocyte et pénétrer dans l’ovocyte. Bien que la mobilité du spermatozoïde soit essentielle pour qu’il parvienne jusqu’à l’ovocyte, la morphologie du spermatozoïde semble également importante pour assurer le succès de la fécondation in vitro.
Ovocytes en contact avec des spermatozoïdes
L’ICSI - « intracytoplasmic sperm injection »
Avec
cette technique, un spermatozoïde est directement injecté dans
l’ovocyte à l’aide de pipettes en verre très fines. Un microscope
équipé d’une excellente optique et une paire de micromanipulateurs sont
nécessaires pour l’ICSI.
Technicien procédant à une ICSI
Préparation des ovocytes
Il
est nécessaire que l’ovocyte soit bien visible pour permettre
l’injection d’un spermatozoïde. Pour cela, les cellules du cumulus qui
entourent l’ovocyte sont éliminées en utilisant une enzyme appelée
hyaluronidase.
Détermination de la maturité de l’ovocyte
Seul
un ovocyte mature peut être fécondé. L’ovocyte mature se trouve en
métaphase de la seconde division méiotique (métaphase II) et se
caractérise par la présence du 1er globule polaire dans l’espace
périvitellin (entre la surface de l’ovocyte et la zone pellucide).
L’ovocyte totalement immature se trouve au stade diplotène de la
prophase I et présente un grand noyau appelé vésicule germinale.
L’ovocyte en cours de maturation se trouve à un stade intermédiaire de
la méiose; il n’a plus de vésicule germinale mais le 1er globule
polaire n’est pas encore apparu. La maturation de l’ovocyte se fait
dans l’ovaire en réponse à l’hCG injecté pour le «déclenchement» de
l’ovulation. Elle est en général achevée lors du recueil des ovocytes
mais il arrive que quelques uns des ovocytes soient encore immatures.
Les ovocytes immatures représentent en général une faible proportion
des ovocytes récoltés. Ces ovocytes sont laissés en culture et ne sont
injectés que s’ils parviennent à maturité in vitro.
Ovocyte et son globule polaire
Sélection du spermatozoïde
Les
spermatozoïdes mobiles et si possible de morphologie normale sont
choisis pour être injectés. La mobilité est importante car elle signale
que le spermatozoïde est vivant. Pour ralentir la vitesse de
déplacement des spermatozoïdes, on ajoute du polyvinyilpyrrolidone
(PVP, 10%) à la suspension juste avant usage. Une goutte (5 µl) de
cette suspension est déposée sur un support et recouverte d’huile. Sous
le microscope, le spermatozoïde sélectionné est immobilisé en
comprimant sa queue contre le support avec la pipette d’injection et
aspiré dans celle-ci, la queue en premier. L’immobilisation du
spermatozoïde est nécessaire pour éviter que des lésions soient
induites par les mouvements du spermatozoïde dans le cytoplasme et pour
permettre l’activation de l’ovocyte.
Mise en place de l’ovocyte
L’ovocyte
à injecter est placé dans un goutte de milieu (5 µl) recouverte d’huile
et maintenu en place avec une pipette de contention («holding
pipette»). Le 1er globule polaire est placé à 6h de telle sorte que le
fuseau méiotique, sur lequel sont disposés les chromosomes maternels et
qui est en général proche du globule polaire, ne se trouve pas sur la
trajectoire de la pipette d’injection.
Pénétration de la membrane plasmique (oolemma) et injection du spermatozoïde
L’oolemma
n’est pas toujours facile à percer avec la pipette d’injection. Pour
faciliter la rupture de l’oolemma, la pipette d’injection contenant le
spermatozoïde est enfoncée profondément dans l’ovocyte et un peu du
cytoplasme est immédiatement aspiré jusqu’à ce que la membrane de
l’ovocyte se rompe. A ce moment le cytoplasme aspiré est doucement
réinjecté dans l’ovocyte et le spermatozoïde déposé dans le cytoplasme
avec un minimum de milieu. La pipette d’injection est délicatement
retirée, et l’ovocyte est libéré de la pipette de contention et
immédiatement mis en culture.
Le spermatozoïde est dans la pipette de micro-injection
La pipette de micro-injection perce la membrane de l'ovocyte
La pipette est engagée jusqu'au centre de l'ovocyte
Le spermatozoïde est introduit dans l'ovocyte
La pipette de micro-injection est retirée laissant une petite cicatrice qui disparaîtra rapidement
Observation de la fécondation (Jour 1)
Il
est important de déterminer que la fécondation a eu lieu et qu’elle est
normale. La fécondation normale se traduit par l’expulsion du 2ème
globule polaire dans l’espace périvitellin et la présence de 2
pronuclei dans l’ovocyte. Les pronuclei contiennent le matériel
génétique du père et de la mère respectivement. Les pronuclei peuvent
apparaître quelques heures après l’insémination conventionnelle ou
l’ICSI et sont souvent encore visibles 20h plus tard. Par commodité,
les ovocytes sont généralement observés le lendemain du recueil
ovocytaire, 14 à 18h après l’insémination. Les ovocytes fécondés sont
également appelés zygotes.
Ovocyte fécondé présentant 2 pronuclei et 2 globules polaires
Après une FIV conventionnelle, les cellules qui sont encore associées à l’ovocyte (la corona radiata) doivent être détachées pour que le cytoplasme soit visible. Des mouvements de va-et-vient de l’ovocyte dans une pipette ayant un diamètre légèrement supérieur à l’ovocyte permettent le détachement des cellules de la corona radiata. Cette procédure s'appelle la décoronisation.
Oocyte entouré de la corona radiata
Aspiration de l'ovocyte dans la pipette
Détachement des cellules de la corona radiata
Zygotes surnuméraires
Dans
de nombreux cas, le nombre de zygotes obtenus est supérieur au nombre
maximum d’embryons qui seront transférés dans l’utérus, à savoir 2 ou
3. Par conséquent, 2 ou 3 zygotes sont maintenus en culture en vue du
transfert alors que les autres (zygotes surnuméraires) sont congelés.
Ces zygotes congelés pourront être transférés dans l’utérus lors d’un
cycle ultérieur.
Echec de fécondation
Bien que nous
n’en connaissions pas toutes les raisons, un échec de fécondation peut
se produire. En FIV conventionnelle, les spermatozoïdes peuvent
présenter une anomalie (mobilité insuffisante, morphologie altérée,
présence d’anticorps, anomalie non définie) qui les empêchent de
féconder l’ovocyte. L’immaturité des ovocytes peut aussi être une cause
d’échec de fécondation.
Bien qu’un échec de fécondation soit rare
après ICSI, il se rencontre plus fréquemment lorsque seuls quelques
ovocytes ont été injectés (de 1 à 3). L’absence d’activation de
l’ovocyte, due à une anomalie de l’ovocyte ou du spermatozoïde, semble
être la cause la plus probable de l’échec de fécondation après ICSI.
Cependant pour un couple donné, un échec de fécondation dans un cycle
ICSI ne signifie pas forcément qu’un second échec aura lieu lors d’un
traitement ultérieur.
Fécondation anormale
La
fécondation est anormale lorsque plus de 2 pronuclei sont présents.
Dans la FIV conventionnelle, ce phénomène est très probablement du à
l’entrée de plusieurs spermatozoïdes dans l’ovocyte alors que dans
l’ICSI, on pense que l’absence d’émission du 2ème globule polaire de
l’ovocyte en est la cause. La présence d’un seul pronucleus est
également une situation anormale car il s’agit d’une activation du
développement se produisant sans le concours du spermatozoïde. Les
ovocytes fécondés anormalement ne sont jamais utilisés pour le
traitement.
Ovocyte triploïde (avec 3 pronuclei)
Développpement embryonnaire (Jour 2-6)
La
disparition des pronuclei indique que les chromosomes paternels (amenés
par le spermatozoïde fécondant) et maternels (présents dans l’ovocyte)
se sont regroupés pour former le génome embryonnaire et que l’ovocyte
fécondé se prépare à la 1ère division cellulaire. Les premières
divisions sont visibles le lendemain de l’observation des pronuclei. En
général, l’embryon présente 2 à 4 blastomères au jour 2, 4 à 8
blastomères au jour 3 et atteint le stade du blastocyste aux jours 5 ou
6. Le blastocyste est le stade auquel l’embryon s’implante dans
l’utérus. Bien que la plupart des zygotes atteignent les premiers
stades de division (2-4 blastomères), environ la moitié donnera des
blastocystes. Notre pratique est de laisser les embryons en culture
jusqu’au jour 3 avant de les transférer dans la cavité utérine.
Embryon à 2 blastomères
Embryon à 4 blastomères
Embryon à 16 blastomères (morula)
Blastocyste
Transfert d’embryons (Jour 3)
Les embryons sont transportés du laboratoire à la salle de transfert qui est équipée d’une petite hotte à flux laminaire chauffante et d’un microscope. Cette installation nous permet de placer les embryons dans le cathéter de transfert juste à côté de la patiente. Le transfert d’embryons a lieu en général au jour 3, lorsque les embryons ont 4 à 8 blastomères. Au maximum 3 embryons sont transférés dans la cavité utérine à l’aide d’ un cathéter. Sous le microscope, les embryons sont aspirés dans le cathéter avec un minimum de milieu de culture. Le médecin introduit ensuite rapidement le cathéter dans la cavité utérine et dépose les embryons dans celle-ci.
Congélation des embryons
D’un
point de vue biologique, la congélation des embryons peut se faire à
différents stades: lors des premières divisions cellulaires (2-4
blastomères) ou au stade du blastocyste. La congélation peut également
se faire au stade du zygote, lorsque les 2 pronuclei sont présents (à
ce stade, il ne s’agit pas encore d’un embryon). Malheureusement, avec
les techniques dont nous disposons actuellement, il n’est pas possible
de congeler des ovocytes sans les endommager.
Dans notre laboratoire, nous congelons les zygotes surnuméraires le jour de l’observation de la fécondation (jour 1). Afin de ne pas endommager le zygote et de préserver son potentiel de développement, il faut le congeler avant la syngamie, c’est-à-dire avant la disparition des pronuclei, et après la synthèse d’ADN, qui a lieu environ 10 à 16h après l’insémination, en prévision de la 1ère division cellulaire. De manière générale, nous congelons les zygotes entre 18 et 20h après l’insémination.
Pour protéger le zygote de la congélation, on ajoute des cryoprotecteurs (1,2-propanediol et sucrose) à la solution de congélation. Après équilibration avec la solution de congélation, les zygotes sont placés dans des paillettes qui sont mises dans un appareil permettant de contrôler très précisément la vitesse de refroidissement et d’induire la cristallisation à un moment déterminé. La congélation se fait très lentement de telle sorte à éviter la formation de gros cristaux de glace à l’intérieur du zygote. Les zygotes sont ensuite conservés à très basse température dans de l’azote liquide (-196 °C).
Transfert d’embryons congelés
La
veille du transfert prévu, les zygotes sont décongelés, lavés pour
éliminer les cryoprotecteurs et mis en culture jusqu’au lendemain pour
qu’ils effectuent leur première division cellulaire. Bien qu’en
moyenne, 75% des zygotes survivent à la congélation, il peut arriver
que, pour un couple donné, aucun de leurs zygotes ne survive. Dans ce
cas, le transfert est annulé.
Pour en savoir plus sur le laboratoire
Généralités
En dehors du corps humain, les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et les embryons doivent être maintenus constamment à une température de 37°C, dans un environnement stérile et dans un milieu de culture adéquat. Au laboratoire, des unités chauffantes permettent de garantir une température constante de 37°C. Pour protéger les gamètes et embryons de toute infection, tout le matériel utilisé est stérile et jeté après usage, toutes les manipulations se font dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Les embryons doivent également être à l’abri de tout agent toxique : tout le matériel utilisé qui entre en contact avec le milieu ou les embryons (boîte de Petri, tubes, pipettes, seringue, cathéter) doit être par conséquent soigneusement sélectionné. Une attention particulière est apportée à l’identification des patients :le nom de la patiente est inscrit sur toutes les boîtes, tubes ou paillettes contenant ses gamètes ou embryons.
Culture embryonnaire
La
culture des embryons se fait dans des petites gouttes (20m l) de milieu
de culture déposées au fond d’une boîte de Petri et recouvertes d’huile
pour éviter l’évaporation, limiter les échanges gazeux et protéger des
contaminations. Les boîtes sont gardées dans un incubateur dont la
température est fixée à 37°C et dont l’air est enrichi en CO2 (5%).
Pour éviter de les perturber, l’observation des embryons au microscope
est limitée au strict minimum . Lorsque les embryons doivent être
déplacés ou changés de milieu, ils sont manipulés à l’aide d’une
pipette en verres très fines (la taille d’un embryon représente environ
un dixième de millimètres) sous une loupe binoculaire équipée d’un
plaque chauffante, dans un environnement stérile.
Milieux de culture
Les
milieux de culture jouent un rôle très important dans la FIV car ils
apportent les éléments métaboliques nécessaires à la survie des gamètes
et permettent aux phénomènes biologiques (tels que la mobilité des
spermatozoïdes, la fécondation, les divisions cellulaires, l’activation
génomique, la différenciation des cellules embryonnaires et du
trophectoderme) de se produire normalement. Le spermatozoïde, les
ovocytes et les embryons n’ont pas tous les mêmes besoins métaboliques,
de plus les besoins varient en fonction des étapes du développement.
C’est pour cela que l’utilisation de milieux de culture, adaptés à des
étapes particulières du développement in vitro et que l’on appelle «
séquentiels », tend à se généraliser dans les laboratoires FIV. Dans
notre laboratoire, nous utilisons un milieu pour la fécondation et un
autre pour le développement jusqu’au stade de 8 blastomères.
Un immense merci à eux !
Cet article et le contenu de ce blog est privé : Les droits d'auteur
s'appliquent à toute oeuvre de l'esprit, quels qu'en soient le genre,
la forme d'expression, le mérite ou la destination. Tout lecteur de ce
blog doit en respecter les droits de propriété intellectuelle. Il doit
notamment veiller à ne pas reproduire et diffuser les articles et
contributions publiées sur ce blog sur d'autres blogs, forums ou
d'autres supports sans l'accord de son auteure. Tout lecteur peut
néanmoins reproduire diffuser de courts extraits d'un article ou
d'un message, à des fins d'information ou de recherches, en citant « http://parcoursfivette.canalblog.com/